层析介质的清洁再生

一、简介

层析技术是生物药物生产中最关键的纯化步骤。生物药物经培养、收集后，通过层析介质分离纯化，最终获得符合质量要求的产品。在此过程中，物料中的杂质也污染了层析介质。这些污染物包括宿主蛋白、核酸、脂类、培养代谢产物、内毒素、杂菌及试剂杂质等，在下一次的分离纯化中可能会污染目标产品，因此必须通过层析介质清洗（CIP）过程将其去除或降至安全水平。

层析介质属于消耗品，经多次使用与清洗后，若污染物残留量超出安全阈值，其使用寿命即告终止，只有更换新的层析介质才能保证生物药品的质量。

 

二、杂蛋白的清洗

在物料中含有大量的杂蛋白，这些杂蛋白根据性质不同，可分为：可溶性杂蛋白、沉淀蛋白、疏水性蛋白、脂蛋白或脂类。

1.可溶性杂蛋白的清洗方法:

凝胶过滤介质：一般使用0.1-0.5M的NaOH清洗0.5-1个(CV)柱床体积；然后超纯水1-2个CV。

离子交换介质：2MNaCl清洗0.5CV；或至少接触10-15min。

疏水层析介质：超纯水(低离子强度的缓冲液)清洗2-3个CV，或使用30%异丙醇清洗2-3个CV。

亲和层析介质：根据层析介质的性质使用适当的缓冲液清洗可溶性杂蛋白。

2.沉淀蛋白的清洗方法:

a.GF/IEX/HIC层析介质：0.5-1MNaOH清洗3-4个CV，然后使用超纯水冲洗pH至中性。

b.亲和层析介质：一般使用尿素或盐酸胍清洗1-2个CV。

3.疏水性杂蛋白或脂蛋白的清洗方法:

a.GF/IEX/HIC层析介质：0.5-1MNaOH清洗3-4个CV，然后使用超纯水冲洗pH至中性。

b.亲和层析介质：一般使用尿素或盐酸胍清洗1-2个CV。

4.脂类杂质的清洗方法:

对于吸附较强的脂类可以优化70%的乙醇或30%的异丙醇清洗1-2个CV。

 

三、内毒素的去除

内毒素是生物制药工艺生产中必须去除的物质，NaOH对内毒素有较好的去除效果，在内毒素的去除试验中0.5-1.0MNaOH的浓度作用4-6h会有较好的效果。但是在实际的生产中，如果是连续生产中的CIP时，一般使用0.1-0.5MNaOH接触15-30min或清洗1个CV就可完成去除残余内毒素以及层析介质的消毒工作。对于已经保存了一段时间的层析介质，一般需要较长的时间，做去除内毒素与消毒工作。

 

四、核酸及病毒的去除

核酸带负电，与阴离子交换吸附较强，实践证明1MNaOH+1MNaCl对核酸的去除效果较好。病毒的灭活在工业生产中是极为重要的。尤其是动物细胞来源的表达产物，对病毒的要求较高。NaOH对病毒的灭活有较好的作用。

 

Ni亲和填料专属清洗策略

 

*每一步水洗都是为去除介质溶液中的其它物质。

*EDTA是螯合剂，脱过渡金属离子。

*NaCl用于除去介质中以离子作用结合或者非特异性结合的物质。

*NaOH用于去除沉积在介质上的蛋白和脂类物质。

*NiSO₄为介质提供过渡金属离子。

*EtOH用于介质保存。