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化学发光羧基磁珠偶联 SA 和抗体的实验技术指南
人阅读 发布时间：2022-03-23 18:01
化学发光免疫分析技术（chemiluminescence immunoasssay, CLIA）是目前世界公认的先进的免疫诊断技术，具有灵敏度高、特异性强、检测线性范围宽等优势，现已广泛应用于肿瘤标志物、传染病、内分泌功能和激素等方面的诊断。磁珠法化学发光免疫技术是将磁性分离技术、化学发光技术和免疫分析技术三者相结合的分析方法。磁珠在化学发光免疫分析技术中起到载体的作用，可以偶联抗体、抗原或者链霉亲和素等。为度生物作为一家专注于磁珠开发与创新的公司，我们将在本文介绍一下羧基磁珠偶联链霉亲和素（SA）和抗体的实验方法及偶联实验过程中的一些注意事项。
EDC 通过与磁珠上的羧基进行反应，形成一种促发剂-----不稳定的脲衍生物， NHS 通过形成更稳定的酯而增强碳二亚胺交联产物的稳定性。交联过程中 EDC、NHS 不进入最终产物中，而是转变成水溶性的脲衍生物。
二、羧基磁珠偶联链霉亲和素（SA）
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1.1. 活化剂：EDC 和 NHS
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1.2. 反应温度：37℃ 环境
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1.3. 反应时间：
1.3.1 偶联时间：2 h
1.3.2 封闭时间：1 h
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1.4 封闭要求：封闭时间不宜小于 1 h。
2. 偶联流程
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2.1 配制偶联实验所用的缓冲液，分别有以下几种：
2.1.1 偶联液：100 mM MES pH4.8
2.1.2 封闭液：3M ETA，1%BSA，0.5%T-20，pH8.0
2.1.3 保存液：0.05%proclin-300 的 PBS 缓冲液或者根据自己的需求配制其他缓冲液。
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2.2 先将磁珠用旋涡振荡器混匀，磁珠用量根据所需取用，置于 EP 管中，加入偶联液，使磁珠的终浓度为 5 mg/mL，使用旋涡振荡器混匀，后置于磁性分离架上，富集磁珠，去除上清，后再加入偶联液重复清洗一次。
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2.3 计算所需 SA 的体积，先加入偶联液，旋涡震荡混匀，再加入 EDC 和 NHS，最后加入 SA，然后继续旋涡混匀，后置于 37℃ 环境旋转混匀反应 2 h。EDC 与 NHS 的比例为 1:1，此偶联反应中，EDC 和 NHS 的终浓度都是 1.5 mg/ml，SA 与磁珠的比例为 1:25，磁珠的终浓度亦为 5 mg/mL。
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2.4 偶联反应完成后，将 EP 管置于磁性分离架上，去除上清，加入封闭液，此时，磁珠的终浓度为 5 mg/mL，同样置于 37℃ 环境旋转混匀反应 1 h。
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2.5 封闭完成后，重复 2.2 步骤，最后将磁珠用保存液保存，此时磁珠的浓度可自定。
三、羧基磁性微球偶联抗体
1. 偶联条件
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1.1. 活化剂：EDC 和 NHS
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1.2. 反应温度：37℃ 环境
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1.3. 反应时间：
1.3.1 活化时间：30 min
1.3.2 偶联时间：2 h
1.3.3 封闭时间：1 h
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1.4 封闭要求：封闭时间不宜小于 1 h。
2. 偶联流程
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2.1 先将偶联所用的缓冲液配制好，分别有以下几种：
2.1.1 偶联液：100 mM MES pH4.8
2.1.2 封闭液：3M ETA，1%BSA，0.5%T-20，pH8.0
2.1.3 保存液：0.05%proclin-300 的 PBS 缓冲液或者根据自己的需求配制其他缓冲液。
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2.2 先将磁珠用旋涡振荡器混匀，磁珠用量根据所需取用，置于 EP 管中，加入偶联液，使磁珠的终浓度为 5 mg/mL，使用旋涡振荡器混匀，后置于磁性分离架上，富集磁珠，去除上清，后再加入偶联液重复清洗一次。
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2.3 计算所用 EDC 和 NHS 的量，EDC 和 NHS 的终浓度都是 1.5 mg/ml，磁珠的终浓度亦为 5 mg/mL。先加入偶联液，旋涡震荡混匀，再加入 EDC 和 NHS，再次旋涡震 荡混匀，后置于 37℃ 环境旋转混匀反应 30 min。
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2.4 磁珠活化完成后，将其置于磁性分离架上，去除上清，并计算所需抗体的体积。 先加入偶联液，旋涡震荡混匀，后加入抗体，再次旋涡震荡混匀，然后置于 37℃ 环境旋转混匀反应 2 h。此偶联反应中，抗体与磁珠的比例为 1:50，磁珠的终浓度为 5 mg/mL。
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2.5 偶联反应完成后，将 EP 管置于磁性分离架上，去除上清，加入封闭液，此时，磁珠的终浓度为 5 mg/mL，同样置于 37℃ 环境旋转混匀反应 1 h。
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2.6 封闭完成后，重复 2.2 步骤，最后将磁珠用保存液保存，此时磁珠的浓度可自定。
四、 注意事项：
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当蛋白浓度 ≥ 2 mg/mL，会增加磁珠与蛋白的接触面积，使得磁珠在单位面积内捕获相对更多的蛋白，偶联效率会增高，但需根据成本和使用要求综合考虑。
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偶联液中不能带有伯氨基的成分，比如 Tris，甘氨酸，BSA 等。在羧基磁珠与蛋白的偶联过程中，是通过磁珠上面的羧基与蛋白的氨基缩合反应形成，所以在偶联过程中，偶联液中不能带有伯氨基的成分。
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EDC 和 NHS 溶液需要现配现用。EDC 容易受潮和降解，可以现配现用，以保证实验过程的可靠性。
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偶联过程中的各种条件可依据具体情况做适当调整。
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