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技术干货|基于微球的免疫层析技术指南
人阅读 发布时间：2022-01-10 11:02
免疫层析技术是出现于 20 世纪 80 年代初期，其本质是免疫反应在层析上的体现，是一种将免疫标记技术和层析技术结合的新型检测技术。微球是免疫层析标记中必不可少的原材料之一，研发人员会根据项目需求和微球理化特性来选择更合适的微球产品。免疫层析技术的原理看似简单，但是研发人员在使用微球进行免疫层析实验过程中常会遇到各种困难。为度作为专注微球开发与创新的公司，我们汇总了一些免疫层析实验中常会遇到的一些问题，并记录了我们的经验和总结，通过本文与您一起分享、讨论。
一、免疫标记技术
1. 活化
微球免疫标记常用的活化剂有 EDC 和 NHS。EDC 是极溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中，用作羧基的活化试剂，使用时的 PH 范围一般为 4.0-6.0，常和 NHS 连用，以提高偶联效率。在活化微球上的羧基时，微球跟活化剂的质量比，EDC 跟 NHS 的质量比都有一个合适的比例，过少会导致活化不充分，偶联效率低，最终降低灵敏度；过高会导致微球聚集发生形态改变，也会降低偶联效率。例如，如下图所示当 EDC 过量达到 1.4 mg 时，离心过后微球聚集，形态较差，严重影响标记。
2. 偶联
在同样的体系下，用微球标记不同的抗体，有些抗体会出现聚沉，导致该现象发生的主要原因是不同抗体的等电点存在差异。当体系的 PH 不合适该抗体会导致电荷分布不均匀，从而产生不同程度的聚沉现象，如下图所示。因此偶联不同的抗体时，可以尝试对体系的 PH 做出调整，从而找到该抗体适合的抗体
3. 封闭环节
微球与抗体通过共价键结合，然而微球上未结合抗体的表面仍然有吸附其他蛋白的能力，会干扰后续特异性反应。牛血清白蛋白普遍被认为是非常好的封闭剂，也可用脱脂奶粉、明胶等替代。
二、层析技术
微球在层析技术中的应用关键是释放过程，如果微球释放过快，则在层析过程中释放不完全；如果微球释放过慢，则会影响释放过程，因此选择一个合适孔径和爬速的膜是层析技术中的重要步骤。以下我们会介绍微球在层析标记中膜的选择的一些注意事项。
1. NC 膜的选择
在免疫层析技术中，通常选择将特异性抗体或抗原固定在大孔径的微孔滤膜（NC 膜）上，根据我们多家测试比对结果，推荐使用 sartorius - CN140 的膜作为 NC 膜，但也需要根据实际项目需求调整 NC 膜类型。
2. 样品垫和释放垫的材质及型号
不同材质或不同型号的样品垫和释放垫也会影响微球的释放。一般而言，针对彩色微球和时间分辨荧光微球推荐选用玻璃纤维材质的、亲水性的膜作为样品垫或结合垫。如下图两种不同型号释放垫的释放对比：
三、彩色微球和时间分辨荧光微球在免疫层析技术中的应用
为度生物可以提供连接了羧基基团的彩色微球和时间分辨荧光微球满足客户免疫层析实验和应用的需求。彩色微球和时间分辨荧光微球在免疫层析应用中各具优势：
四、为度免疫层析相关微球推荐
红色羧基乳胶微球
链霉亲和素修饰（SA）红色乳胶微球
羧基修饰时间分辨荧光微球
一、免疫标记技术
微球免疫标记抗体包含清洗-活化-清洗-偶联-封闭-清洗-复溶保存 7 个步骤，其中活化、偶联和封闭是免疫标记的重要环节。以下我们会介绍微球在免疫标记中活化、偶联和封闭实验过程中的一些注意事项。
1. 活化
微球免疫标记常用的活化剂有 EDC 和 NHS。EDC 是极溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中，用作羧基的活化试剂，使用时的 PH 范围一般为 4.0-6.0，常和 NHS 连用，以提高偶联效率。在活化微球上的羧基时，微球跟活化剂的质量比，EDC 跟 NHS 的质量比都有一个合适的比例，过少会导致活化不充分，偶联效率低，最终降低灵敏度；过高会导致微球聚集发生形态改变，也会降低偶联效率。例如，如下图所示当 EDC 过量达到 1.4 mg 时，离心过后微球聚集，形态较差，严重影响标记。
2. 偶联
在同样的体系下，用微球标记不同的抗体，有些抗体会出现聚沉，导致该现象发生的主要原因是不同抗体的等电点存在差异。当体系的 PH 不合适该抗体会导致电荷分布不均匀，从而产生不同程度的聚沉现象，如下图所示。因此偶联不同的抗体时，可以尝试对体系的 PH 做出调整，从而找到该抗体适合的抗体
3. 封闭环节
微球与抗体通过共价键结合，然而微球上未结合抗体的表面仍然有吸附其他蛋白的能力，会干扰后续特异性反应。牛血清白蛋白普遍被认为是非常好的封闭剂，也可用脱脂奶粉、明胶等替代。
二、层析技术
层析试纸条主要包括四个部分：样品垫、结合物释放垫、NC 膜和吸水垫。
微球在层析技术中的应用关键是释放过程，如果微球释放过快，则在层析过程中释放不完全；如果微球释放过慢，则会影响释放过程，因此选择一个合适孔径和爬速的膜是层析技术中的重要步骤。以下我们会介绍微球在层析标记中膜的选择的一些注意事项。
1. NC 膜的选择
在免疫层析技术中，通常选择将特异性抗体或抗原固定在大孔径的微孔滤膜（NC 膜）上，根据我们多家测试比对结果，推荐使用 sartorius - CN140 的膜作为 NC 膜，但也需要根据实际项目需求调整 NC 膜类型。
2. 样品垫和释放垫的材质及型号
不同材质或不同型号的样品垫和释放垫也会影响微球的释放。一般而言，针对彩色微球和时间分辨荧光微球推荐选用玻璃纤维材质的、亲水性的膜作为样品垫或结合垫。如下图两种不同型号释放垫的释放对比：
三、彩色微球和时间分辨荧光微球在免疫层析技术中的应用
为度生物可以提供连接了羧基基团的彩色微球和时间分辨荧光微球满足客户免疫层析实验和应用的需求。彩色微球和时间分辨荧光微球在免疫层析应用中各具优势：
四、为度免疫层析相关微球推荐
红色羧基乳胶微球
链霉亲和素修饰（SA）红色乳胶微球
羧基修饰时间分辨荧光微球
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