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为度生物 CleanNGS 应用于 NGS 文库制备和片段筛选应用分享
人阅读 发布时间：2021-11-25 16:07
随着高通量测序的不断发展，对核酸文库的高质量纯化及文库片段大小筛选方法的需求日益增加。 新的趋势是样品的投入量在减少，NGS 文库制备目前允许样品量低至皮克级别。因此，具有高回收率、高纯度和精确片段筛选能力的纯化技术是至关重要的。CleanNGS 就是专为满足精确的片段筛选和 NGS 文库制备过程中提供高纯度和高回收率而设计。CleanNGS 无 RNA 酶生产体系，DNA 与 RNA 纯化均可适用。我们将结合以下案例分享 CleanNGS 在文库制备和片段筛选中的应用。
应用分享一：文库制备
1、实验设计
用 Covaris S2 将人类基因组 DNA (Bioline) 剪切成 150、200、400 和 1000 bp 的片段，合并在一起成为基因组 DNA 片段池；使用 1.8 倍比例（18μL）的合适的磁珠（3x CleanNGS; 3x Competitor A）将 10μL 浓度为 1.5-1.8 ng/μL 的基因组 DNA 片段池纯化成 6 个系列，无核酸酶水作为 NTC(空白对照)。与磁珠结合后用 80% 乙醇洗涤两次，室温干燥 5 分钟；在含纯化基因组 DNA 的微球中加入 20 μL SYBR master mix，然后使用 Bio-Rad CFX Touch 进行珠式 qPCR，采用 RPL13A-F 和 RPL13A-R 引物进行 qPCR。
图1. 实验设计思路
2、实验结果和讨论
CleanNGS 的平均 Ct 值为 19.20，竞品 A 为 21.15。每个样本的 Ct 值如表 1 所示。相应扩增结果如图 1 所示。
表 1. CleanNGS 与竞品 A 的珠式 qPCR 的 Ct 值比较
图2. 珠式 qPCR 扩增图
qPCR 的结果表明 CleanNGS 为 NGS 的应用提供了一种无抑制作用的解决方案。通过实验，证明了 CleanNGS 和竞品 A 的效率相同。 通过进行珠式 qPCR，我们证明了 DNA 和/或 RNA 纯度、浓度以及与竞品 A 相比，CleanNGS 微球不会引起任何 qPCR 抑制。对比 CleanNGS 与竞品 A，发现使用 CleanNGS 进行的 qPCR 的平均 Ct 值降低了 2 个 Ct。这表明，综合考虑纯度和回收率 (最终收率)，CleanNGS 纯化的平均性能优于竞品 A。由于 CleanNGS 可以手动和自动化使用，能够广泛适用于 NGS 实验室，适用不同样本量的需求。
应用分享二：NGS 文库制备中片段筛选和纯化
1、实验设计
对于单细胞测序文库的制备，我们使用了平行重复的 4 个单细胞文库， 其中一份使用 CleanNGS，在另一份相同的文库中使用竞品 A 来进行纯化和片段筛选。
制备文库的流程如下所示：
2、结果
文库制备后，比较 CleanNGS 和竞品 A 的纯化回收率和片段筛选能力。使用 Agilent BioAnalyzer 比较文库片段大小，而最终文库浓度和回收率是通过使用 DeNovix DS-11 FX 和 DeNovix Broad Range Assay 的荧光测量来确定的。文库平均大小和浓度如表 2 所示。
表 2. CleanNGS 与竞品 A 文库浓度和平均片段大小的比较
相应的 BioAnalyzer 数据如图 2 到图 6 所示：显示了使用 CleanNGS 和竞品 A 处理后的样品的电泳图。
图 3. 生物分析仪文库数据 L = 梯度标志物，样本 1-4 = 竞品 A, 样本 5-8 = CleanNGS
图 4. 文库 1， 竞品 A
图 5. 文库 1， CleanNGS
图 6. 文库 2， 竞品A
图 7. 文库 2，CleanNGS
结论和讨论
单细胞文库的制备表明 CleanNGS 可以在 NGS 的应用中提供一种解决方案。在文库制备的过程中 CleanNGS 可以提供高回收率和精准的片段筛选能力。和竞品 A 相比，筛选的片段平均差异为 1bp，因此可以认为筛选的片段长度是一致的。另外考虑到 Agilent BioAnalyzer 的大小分辨率 ≥ 5 bp。在这个范围内，比较片段筛选能力表明两种试剂盒性能表现相同。
与竞争对手 A 相比，如表 2 所示，在本实验中使用的样品上，回收率平均提高了 5%。通过改进 CleanNGS 的缓冲液成分后，与竞品 A 相比，它可以更有效地结合 DNA/RNA。CleanNGS 即使在实验起始 DNA/RNA 样本量极低的情况下，仍可保障 DNA/RNA 的理想回收率，这使得 CleanNGS 更具有优势。
应用分享一：文库制备
1、实验设计
用 Covaris S2 将人类基因组 DNA (Bioline) 剪切成 150、200、400 和 1000 bp 的片段，合并在一起成为基因组 DNA 片段池；使用 1.8 倍比例（18μL）的合适的磁珠（3x CleanNGS; 3x Competitor A）将 10μL 浓度为 1.5-1.8 ng/μL 的基因组 DNA 片段池纯化成 6 个系列，无核酸酶水作为 NTC(空白对照)。与磁珠结合后用 80% 乙醇洗涤两次，室温干燥 5 分钟；在含纯化基因组 DNA 的微球中加入 20 μL SYBR master mix，然后使用 Bio-Rad CFX Touch 进行珠式 qPCR，采用 RPL13A-F 和 RPL13A-R 引物进行 qPCR。
图1. 实验设计思路
2、实验结果和讨论
CleanNGS 的平均 Ct 值为 19.20，竞品 A 为 21.15。每个样本的 Ct 值如表 1 所示。相应扩增结果如图 1 所示。
| Sample ID | CleanNGS | Competitor A | NTC |
| 1 | 18.00 | 21.23 | 29.47 |
| 2 | 19.56 | 21.39 | 28.70 |
| 3 | 20.06 | 20.82 | 28.62 |
| Average | 19.20 | 21.15 | 28.93 |
图2. 珠式 qPCR 扩增图
qPCR 的结果表明 CleanNGS 为 NGS 的应用提供了一种无抑制作用的解决方案。通过实验，证明了 CleanNGS 和竞品 A 的效率相同。 通过进行珠式 qPCR，我们证明了 DNA 和/或 RNA 纯度、浓度以及与竞品 A 相比，CleanNGS 微球不会引起任何 qPCR 抑制。对比 CleanNGS 与竞品 A，发现使用 CleanNGS 进行的 qPCR 的平均 Ct 值降低了 2 个 Ct。这表明，综合考虑纯度和回收率 (最终收率)，CleanNGS 纯化的平均性能优于竞品 A。由于 CleanNGS 可以手动和自动化使用，能够广泛适用于 NGS 实验室，适用不同样本量的需求。
应用分享二：NGS 文库制备中片段筛选和纯化
1、实验设计
对于单细胞测序文库的制备，我们使用了平行重复的 4 个单细胞文库， 其中一份使用 CleanNGS，在另一份相同的文库中使用竞品 A 来进行纯化和片段筛选。
制备文库的流程如下所示：
- FACS 流式细胞荧光分选来获得 1 个单细胞
- 单细胞裂解和 RT 引物的退火
- 逆转录
- 预扩增
- 使用 CleanNGS 纯化
- 酶切法片段化
- 片段化酶失活
- PCR 扩增
- 使用 CleanNGS 纯化
- 通过 Agilent 生物信息分析仪和 DeNovix DS-11 FX 来验证文库质量
2、结果
文库制备后，比较 CleanNGS 和竞品 A 的纯化回收率和片段筛选能力。使用 Agilent BioAnalyzer 比较文库片段大小，而最终文库浓度和回收率是通过使用 DeNovix DS-11 FX 和 DeNovix Broad Range Assay 的荧光测量来确定的。文库平均大小和浓度如表 2 所示。
表 2. CleanNGS 与竞品 A 文库浓度和平均片段大小的比较
相应的 BioAnalyzer 数据如图 2 到图 6 所示：显示了使用 CleanNGS 和竞品 A 处理后的样品的电泳图。
图 3. 生物分析仪文库数据 L = 梯度标志物，样本 1-4 = 竞品 A, 样本 5-8 = CleanNGS
图 4. 文库 1， 竞品 A
图 5. 文库 1， CleanNGS
图 6. 文库 2， 竞品A
图 7. 文库 2，CleanNGS
结论和讨论
单细胞文库的制备表明 CleanNGS 可以在 NGS 的应用中提供一种解决方案。在文库制备的过程中 CleanNGS 可以提供高回收率和精准的片段筛选能力。和竞品 A 相比，筛选的片段平均差异为 1bp，因此可以认为筛选的片段长度是一致的。另外考虑到 Agilent BioAnalyzer 的大小分辨率 ≥ 5 bp。在这个范围内，比较片段筛选能力表明两种试剂盒性能表现相同。
与竞争对手 A 相比，如表 2 所示，在本实验中使用的样品上，回收率平均提高了 5%。通过改进 CleanNGS 的缓冲液成分后，与竞品 A 相比，它可以更有效地结合 DNA/RNA。CleanNGS 即使在实验起始 DNA/RNA 样本量极低的情况下，仍可保障 DNA/RNA 的理想回收率，这使得 CleanNGS 更具有优势。
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