磁珠法核酸提取得率低，如何解决？

目前进行核酸检测无论是采用 PCR 平台还是二代测序或者三代测序平台，亦或是其他核酸相关的检测平台，均离不开核酸的分离纯化流程。核酸质量的好坏直接决定着下游的检测成功率。对于某些要求高灵敏度的应用，则对核酸得率有高要求，也是核酸质量评价的关键指标之一。

磁珠法核酸提取具备高通量、快速、简单方便、绿色环保无毒等优势，越来越被大部分企业采用。这里给大家整理出核酸提取得率低的一系列原因，以及如何解决。

▼ 裂解不充分

对于提取胞内核酸的应用，我们需要对细胞进行裂解，释放核酸；但是样本类型复杂多变，不同的样本裂解的难易程度具有很大的不同，当裂解不充分时，释放的核酸有限，即使磁珠的吸附能力再强，也很难获得较高的得率。一般可以通过提高胍盐浓度以及表面活性剂浓度，来增强裂解液的裂解能力，胍盐和表面活性剂能够破坏蛋白的高级结构，促进膜蛋白的变性，使得细胞膜破裂。

▼ 结合能力不足

结合能力不足有两方面的原因，一是磁珠的选择上，选择的磁珠比表面积过小，功能基团较少，从而吸附核酸能力较弱；二是结合缓冲液结合能力弱。

针对第一种情况，可以选择功能基团较多，比表面积大的磁珠，一般而言粒径越小比表面积越大，但同时磁响应也会偏弱，所以磁珠的选择应根据实际样本情况，如果样本偏粘稠，或者对磁响应要求较高，那么小粒径也很难满足要求，这时我们需要选择粒径适中，并提升缓冲液的结合能力入手。

针对第二点，结合缓冲液一般采用醇类结合，比如乙醇，有些厂家缓冲液是直接使用柱法的试剂转换成磁珠法的，会发现在柱法中表现很好的试剂，在磁珠法中得率很低。这是因为柱法不但其硅胶柱具备结合核酸的能力，还有类似「分子筛」的效果。而磁珠法一般是通过静电吸附、疏水作用来结合核酸，所以对于结合液的结合能力要求会更高，一般可以通过提高醇的比例来增强结合能力，同时，也要提高离液盐（胍盐、钠盐等）的浓度来促进核酸与磁珠的结合。

▼ 洗脱不充分

有时候我们裂解结合液各种条件优化到了极致了，可是核酸得率仍然很低。这种情况有可能是磁珠结合了核酸，但是由于洗脱不充分，磁珠结合的核酸没有被洗脱下来。首先，磁珠在晾干过程中可能干燥过度，导致核酸干结在磁珠上不能洗脱下来；第二，洗脱液体积过小导致无法充分洗脱。晾干过程中，需要观察磁珠处于稍微湿润的状态即可，不能完全干燥，这样核酸更容易溶解于洗脱液中。洗脱体积不能太少也不能太多，太少磁珠上的核酸很难洗脱充分，太多会导致浓度偏低。一般来说 0.5mg 的磁珠，洗脱液的体积为 70-100ul。

当然，得率的高低除了上述三种情况，还与样本以及个体差异有关，不同的样本核酸含量差异也比较大。对于微量核酸样本，为度生物具备高吸附性能的核酸提取磁珠，具备较高的比表面积的同时磁响应也能适应大部分应用。


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