oligo(dT) 磁珠 mRNA 纯化中的问题

oligo(dT) 磁珠是在磁珠的表面偶联了一段寡聚核苷酸-胸腺嘧啶核苷酸（T），可以纯化多聚腺苷酸（ploy A+）mRNA 的磁珠。其利用了 mRNA 的 3’端 ployA 尾与磁珠表面的 oligo(dT) 碱基互补配对杂交到磁珠上，而其他没有 ployA 尾的 RNA 不被杂交，从而可以将 mRNA 分离出来。然而，oligo(dT) 磁珠的 mRNA 纯化应用的场景较多，样本类型及状态不同，导致在利用 oligo(dT) 磁珠进行纯化的过程中遇到一些问题。


1、磁珠结块
这种现象一般是磁珠加入样本的粗提物中出现，这种样本中可能含有长链的 DNA，会导致磁珠聚集，磁珠的聚集可能会减少 mRNA 的产量以及降低最终 mRNA 的纯度。可以通过移液器吹打，磁珠分散，使 DNA 断裂成小片段，另外可以将裂解物通过带注射针的注射器，使样品更加均质化，降低液体的粘性。还可以通过添加 DNase I 处理以去除基因组 DNA 。处理的样品量过剩时也会导致磁珠聚集，回收量降低，这时需要考虑减少样品量。

2、反转录抑制
常用的 Lysis/Binding Buffer 和 Washing buffer A中一般都含有 LiDS，LiDS 是下游酶反应的强抑制剂，如果 LiDS 残留在 mRNA 样本中会导致下游的反转录受抑制。建议在每一步洗涤步骤过程中，彻底重悬磁珠，使磁珠分散。另外在最后一步洗涤之前更换一个新的离心管，可提高 LiDS 的去除效率。

3、 mRNA 产量较低
mRNA 产量较低可能有多种原因导致，a 细胞或组织的 mRNA 表达水平较低，应选择合适的表达时期样本；b 磁珠与样本的比例太低，可适当提高磁珠的量或者减少样本体积，增大样本浓度；c 杂交时间过短，提高杂交孵育时间到 10-15 min；d 洗脱不充分，需要适当提高洗脱液的体积，增加洗脱时间，提高洗脱温度，也可以重复洗脱两次，然后混合洗脱产物。

4、rRNA 污染消除
oligo(dT) 磁珠纯化 mRNA 过程中，痕量的 rRNA 污染也会时有发生，对于后续检测是 RT-PCR 或者 Northern blotting 来说，痕量的 rRNA 污染不会干扰检测结果，但是后续应用如果是转录组测序，rRNA 的污染会对测序的数据质量产生影响。如果发生 rRNA 污染，通常可以通过二次提取可极大提高 rRNA 的消除。在洗涤实验操作过程中，仅通过倒转混合有时并不能完全混匀充分，一般可通过移液枪进行混合，使磁珠充分洗净，消除 rRNA 污染。另外，对于大部分 buffer 需要等其恢复至室温后加以使用。
除了以上几点，获得高质量的 mRNA，需要严格控制 RNase 的污染，实验操作的所有器具以及试剂要防止混入 RNase。

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