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乳胶微球偶联/标记技术分享、问题总结
人阅读 发布时间：2019-01-15 09:58
一、乳胶微球的洗涤
Q1：乳胶微球在进行偶联反应之前一般需要洗涤，洗涤之后是否会发生沉淀？
A1：乳胶微球保存液中包含有痕量的表面活性剂和稳定剂，可能对下游的抗体偶联产生一定的影响，洗涤缓冲液可以选择常用的 PBS 或者是其他任何可以用于偶联反应的缓冲液。如果在洗涤过程中微球发生聚集沉淀，可以尝试以旋涡振荡或超声等方式使微球重悬，如微球仍然聚集则应该在洗涤后的微球中重新添加极微量的表面活性剂来维持微球的悬浮状态。
Q2：如何知道洗涤后附着在乳胶微球表面的活性剂已经被彻底去除了？
A2：在乳胶微球偶联抗体之前去除表面活性剂可以使微球很好的处于单分散状态，从而更好的与抗体相结合。大多数的偶联方法推荐对微球洗涤 2-3 次后再进行偶联，这与洗涤的方式有关；同时也与每次洗涤后微球中有多少上清液的残留有关。可以用仪器测量出微球表面活性剂的量，如表面张力的分析，可以知道活性剂是否被去除干净。还有一种简易的判断方法是，拿一个试管装入洗涤微球后的上清液，振荡之后如果上清液表面泡沫在 2-3 秒内就破裂的话可以认为是不含表面活性剂的。
二、乳胶微球的凝集
Q3：保存在瓶子里的乳胶微球发生凝集沉淀现象该如何处理？
A3：通常情况下乳胶微球在 2-8℃ 保存是可以很好的处于悬浮状态，但如果长时间静置的情况下仍会由于重力的作用而发生沉淀现象，在使用前用旋涡振荡以及水浴超声的方式将微球进行重悬。
Q4：微球在偶联过程中发生凝集该如何处理？
A4：微球在偶联过程中发生凝集主要分为以下几种情况：
1. 当加入 EDC 后发生凝集：建议降低微球在反应体系中的浓度，同时 EDC 需缓慢加入，并在加入之后将微球充分混匀；
2. 当加入抗体后发生凝集：建议尝试使用水浴超声的方式看是否可以使微球重悬，如这种凝集现象是可逆的则继续进行实验；如不能使微球重悬则考虑提高抗体的浓度再实验，或尝试使用其他偶联缓冲体系。
三、乳胶微球的偶联效率
Q5：在偶联反应之后，发现抗体与微球的偶联效率低，可能的原因有哪些？
A5：可能的原因有以下几种情况：
1. EDC 的活性不高，建议检查 EDC 是否已经潮解失效，同时 EDC 和 NHS 都需现配现用；
2. 抗体的量不足，建议提高偶联时抗体的浓度；
3. 反应缓冲液不适合，建议调整缓冲液的pH值或更换其他缓冲液；
4. 反应过程中带入了含有氨基基团的其他蛋白，并与目的抗体发生竞争，建议严格检查所使用的试剂避免微球的非特异性吸附。
Q6：在微球偶联抗体之后，发现其非特异性吸附较高，可能的原因有哪些？
A6：可能的原因有以下几种情况：
1. 微球表面基团含量不高，建议使用表面基团更高的微球；
2. 微球在偶联过程中发生凝集，聚集的微球容易导致非特异性吸附，建议在偶联时使用水浴超声的方式使微球保持悬浮状态；
3. 微球没有封闭完全，建议延长微球封闭的时间或更换其他封闭效果好的封闭剂。
四、其他相关问题
Q7：单克隆抗体和多克隆抗体在与乳胶微球结合过程中有什么区别？
A7：由于单克隆抗体与多克隆抗体具有不同的等电点，在与微球结合的过程中表现是不一样的。
多克隆抗体在其等电点时的偶联效果较好，这是因为在该 pH 值条件下抗体的结构处于最佳状态，同时在微球表面所占据的面积也最小。
单克隆抗体要比多克隆抗体具有更好的特异性，但是其与微球的结合力要相对弱一些，同时单克隆抗体通常情况下并不能有效的形成免疫复合物，单克隆抗体的疏水性随着抗体的成熟度的不同而有所不同。另外，某些单克隆抗体的等电点比较低，在这种低 pH 条件下乳胶微球会变的不太稳定而容易引起聚集，因此如果想在相同条件下获得很好的偶联效果需要调整相应的缓冲液以及 pH 值等。
Q8：乳胶微球偶联抗体之后在 2-8℃ 保存一个多月后发生失活，可能的原因是什么？
A8：可能由以下几个方面引起的：
1. 保存缓冲液中封闭剂的浓度：当封闭剂的浓度过高时会与抗体发生竞争现象；
2. 抗体的偶联效率：在偶联时使用更高浓度的抗体会提高其偶联效率，使封闭剂不容易与微球发生反应；
3. 使用 PBS 缓冲液保存，其他缓冲液可能会对溶液的稳定性产生影响。另外需要注意的是随着保存时间的推移溶液中的蛋白会变的更容易吸附到微球的表面，这种抗体活性的丧失可能就是这个原因引起的，因为随着更多蛋白被吸附分子间变的更加的紧密，导致抗体的构象发生改变从而失活，如果确实是这样的话，那么在偶联时应该提高抗体的浓度，使抗体可以更多的偶联到微球表面。
总之，微球使用前需洗涤去除表面活性剂，偶联过程需避免凝集，选择合适的试剂以提高微球偶联效率。
苏州为度生物技术有限公司是一家专注于生物技术领域内微球产品规模化生产与应用的高新技术企业，我司已经通过 ISO9001-2008 质量体系认证。产品主要有乳胶微球、彩色微球、磁性微球、荧光微球、流式微球、标准微球等全系列微球产品，产品粒径均一可控，多种功能指标可进行定制性调节。
我们为客户提供：高质量的纳米级、微米级微球产品；微球产品的个性化定制服务；微球产品的全球 OEM 服务；微球产品的规模化蛋白修饰服务；微球应用中间体的 OEM 服务；微球应用的整体技术解决方案。
苏州为度生物技术有限公司
电话：0512-80905220
传真：0512-80905230
邮箱：vdo@vdobiotech.com
网址：www.vdobiotech.com
邮编：215123
地址：苏州市星湖街 218 号生物纳米园 C29 幢 5 楼
Q1：乳胶微球在进行偶联反应之前一般需要洗涤，洗涤之后是否会发生沉淀？
A1：乳胶微球保存液中包含有痕量的表面活性剂和稳定剂，可能对下游的抗体偶联产生一定的影响，洗涤缓冲液可以选择常用的 PBS 或者是其他任何可以用于偶联反应的缓冲液。如果在洗涤过程中微球发生聚集沉淀，可以尝试以旋涡振荡或超声等方式使微球重悬，如微球仍然聚集则应该在洗涤后的微球中重新添加极微量的表面活性剂来维持微球的悬浮状态。
Q2：如何知道洗涤后附着在乳胶微球表面的活性剂已经被彻底去除了？
A2：在乳胶微球偶联抗体之前去除表面活性剂可以使微球很好的处于单分散状态，从而更好的与抗体相结合。大多数的偶联方法推荐对微球洗涤 2-3 次后再进行偶联，这与洗涤的方式有关；同时也与每次洗涤后微球中有多少上清液的残留有关。可以用仪器测量出微球表面活性剂的量，如表面张力的分析，可以知道活性剂是否被去除干净。还有一种简易的判断方法是，拿一个试管装入洗涤微球后的上清液，振荡之后如果上清液表面泡沫在 2-3 秒内就破裂的话可以认为是不含表面活性剂的。
二、乳胶微球的凝集
Q3：保存在瓶子里的乳胶微球发生凝集沉淀现象该如何处理？
A3：通常情况下乳胶微球在 2-8℃ 保存是可以很好的处于悬浮状态，但如果长时间静置的情况下仍会由于重力的作用而发生沉淀现象，在使用前用旋涡振荡以及水浴超声的方式将微球进行重悬。
Q4：微球在偶联过程中发生凝集该如何处理？
A4：微球在偶联过程中发生凝集主要分为以下几种情况：
1. 当加入 EDC 后发生凝集：建议降低微球在反应体系中的浓度，同时 EDC 需缓慢加入，并在加入之后将微球充分混匀；
2. 当加入抗体后发生凝集：建议尝试使用水浴超声的方式看是否可以使微球重悬，如这种凝集现象是可逆的则继续进行实验；如不能使微球重悬则考虑提高抗体的浓度再实验，或尝试使用其他偶联缓冲体系。
三、乳胶微球的偶联效率
Q5：在偶联反应之后，发现抗体与微球的偶联效率低，可能的原因有哪些？
A5：可能的原因有以下几种情况：
1. EDC 的活性不高，建议检查 EDC 是否已经潮解失效，同时 EDC 和 NHS 都需现配现用；
2. 抗体的量不足，建议提高偶联时抗体的浓度；
3. 反应缓冲液不适合，建议调整缓冲液的pH值或更换其他缓冲液；
4. 反应过程中带入了含有氨基基团的其他蛋白，并与目的抗体发生竞争，建议严格检查所使用的试剂避免微球的非特异性吸附。
Q6：在微球偶联抗体之后，发现其非特异性吸附较高，可能的原因有哪些？
A6：可能的原因有以下几种情况：
1. 微球表面基团含量不高，建议使用表面基团更高的微球；
2. 微球在偶联过程中发生凝集，聚集的微球容易导致非特异性吸附，建议在偶联时使用水浴超声的方式使微球保持悬浮状态；
3. 微球没有封闭完全，建议延长微球封闭的时间或更换其他封闭效果好的封闭剂。
四、其他相关问题
Q7：单克隆抗体和多克隆抗体在与乳胶微球结合过程中有什么区别？
A7：由于单克隆抗体与多克隆抗体具有不同的等电点，在与微球结合的过程中表现是不一样的。
多克隆抗体在其等电点时的偶联效果较好，这是因为在该 pH 值条件下抗体的结构处于最佳状态，同时在微球表面所占据的面积也最小。
单克隆抗体要比多克隆抗体具有更好的特异性，但是其与微球的结合力要相对弱一些，同时单克隆抗体通常情况下并不能有效的形成免疫复合物，单克隆抗体的疏水性随着抗体的成熟度的不同而有所不同。另外，某些单克隆抗体的等电点比较低，在这种低 pH 条件下乳胶微球会变的不太稳定而容易引起聚集，因此如果想在相同条件下获得很好的偶联效果需要调整相应的缓冲液以及 pH 值等。
Q8：乳胶微球偶联抗体之后在 2-8℃ 保存一个多月后发生失活，可能的原因是什么？
A8：可能由以下几个方面引起的：
1. 保存缓冲液中封闭剂的浓度：当封闭剂的浓度过高时会与抗体发生竞争现象；
2. 抗体的偶联效率：在偶联时使用更高浓度的抗体会提高其偶联效率，使封闭剂不容易与微球发生反应；
3. 使用 PBS 缓冲液保存，其他缓冲液可能会对溶液的稳定性产生影响。另外需要注意的是随着保存时间的推移溶液中的蛋白会变的更容易吸附到微球的表面，这种抗体活性的丧失可能就是这个原因引起的，因为随着更多蛋白被吸附分子间变的更加的紧密，导致抗体的构象发生改变从而失活，如果确实是这样的话，那么在偶联时应该提高抗体的浓度，使抗体可以更多的偶联到微球表面。
总之，微球使用前需洗涤去除表面活性剂，偶联过程需避免凝集，选择合适的试剂以提高微球偶联效率。
苏州为度生物技术有限公司是一家专注于生物技术领域内微球产品规模化生产与应用的高新技术企业，我司已经通过 ISO9001-2008 质量体系认证。产品主要有乳胶微球、彩色微球、磁性微球、荧光微球、流式微球、标准微球等全系列微球产品，产品粒径均一可控，多种功能指标可进行定制性调节。
我们为客户提供：高质量的纳米级、微米级微球产品；微球产品的个性化定制服务；微球产品的全球 OEM 服务；微球产品的规模化蛋白修饰服务；微球应用中间体的 OEM 服务；微球应用的整体技术解决方案。
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