Q1：羧基微球偶联抗体时是推荐一步法还是两步法偶联？
A1：一般推荐两步法进行偶联。
一步法的缺点是反应溶液的 pH 值是一个均值，另外最大的缺点是水溶性的碳化二胺既可以结合蛋白同时也可以将所有物质结合在一起，因此很容易使得微球发生团聚，形成的沉淀大小无法控制且分布不均。
两步法包括在低 pH 条件下使微球和水溶性的碳化二胺反应，羧基形成活化中间体，然后洗涤去除未反应的碳化二胺。需要注意的是羧基活化后的中间体不稳定，容易发生水解，因此洗涤的过程必须快速以减少活化基团的水解。当加入抗体后需要调整溶液的 pH 值（pH＞8）使抗体的氨基基团处于游离状态。在偶联反应完成之后，通过洗涤将未结合的抗体去除干净。虽然两步法的步骤更多了，但可以更好的控制反应的每个过程从而避免微球发生凝集。
如果您仍然想要使用一步法进行偶联反应，那么我们推荐您可以做一些适当的调整：
1. 计算出需要被活化的基团的数量； 
2. 加入过量的水溶性碳化二胺将所有基团进行活化，室温下反应时间 0.5 h；
3. 计算出需要偶联到微球上的抗体的数量； 
4. 加入过量的抗体到已活化的微球中进行反应；这种方法只允许微球和抗体之间发生结合反应，而不允许抗体和抗体之间以及微球和微球之间发生结合反应。
以上问答是我们基于自己的经验所整理，若有不同见解，欢迎交流！

Q2：微球偶联实验，刚开始微球是稳定的，但当加入抗体时发生了凝集，该如何解决？
A2：通常情况下可以通过下面的方法来避免微球偶联过程中发生凝集：
1. 在加入抗体溶液前，向微球中加入少量的表面活性剂，使部分微球被表面活性剂所覆盖有助于其在蛋白溶液中抵御电解质的冲击；需注意的是表面活性剂使用量不可过多，否则会导致微球完全被其所包被从而降低与抗体的偶联效率；
2. 可以使用稀释的抗体溶液对微球进行预处理；
3. 尽可能的降低电解质含量 (前提是不使蛋白变性)；
4. 降低微球的浓度 (使微球尽可能的处于分散状态)；
5. 偶联时使用的抗体过量；
6. 将微球加入到抗体溶液中，而不是将抗体加入到微球溶液中去；
7. 使用搅拌器使微球和抗体快速混匀。

Q3：经 BSA 封闭的偶联有 IgG 抗体的微球，在保存一个多月后发生失活的现象，可能是什么原因造成的？
A3：微球试剂稳定性问题可能由以下几个方面引起：
1. 保存缓冲液中 BSA 的浓度：当 BSA 的浓度过高时会与 IgG 抗体发生竞争现象；
2. IgG 抗体偶联率：在偶联时使用更高浓度的 IgG 抗体会提高其偶联效率，使 BSA 不容易与微球发生反应；
3. 用 BSA 作为封闭剂：其他的封闭剂可能并不会达到很好的封闭效果；
4. 使用 PBS 缓冲液：其他缓冲液可能会对溶液的稳定性有所改变。
另外，需要考虑的因素是随着保存时间的推移，溶液中的蛋白会变的更容易吸附到微球的表面，这种抗体活性的丧失可能就是这个原因引起的；因为随着更多蛋白被吸附，分子间变的更加的紧密，导致抗体的构象发生改变从而失活；如果确实是这样的话，那么在偶联时应该提高 IgG 抗体的浓度，使抗体可以偶联到更密集和垂直的微球表面。
为了确切的知道具体的原因，可以测定微球表面蛋白的量是否保持不变；如果保持不变那么意味着 BSA 竞争性的替代了微球表面的 IgG 抗体，或者是由于抗体构象的改变而使其活性丧失。

Q4：微球偶联抗体的过程中，如何避免发生非特异性吸附？
A4：避免发生非特异性吸附的方法：
1. 将抗体吸附到微球上并采用 BSA、明胶或其他蛋白进行封闭处理，但这种方法并不能保证杂蛋白也不被吸附；  
2. 通过共价偶联的方法可以将抗体永久的结合到羧基微球表面，然后加入适量（1-5%）的含封闭蛋白或不含封闭蛋白的表面活性剂 (如 Tween20)；表面活性剂的量可以根据实际需要进行调节，直到不发生非特异性吸附为止，由于是共价偶联因此不必担心抗体会从微球上脱落。

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